皮肤真菌荧光染色液操作指南：从采样到判读的完整流程

一、样本采集：精准定位感染部位

皮肤样本

消毒与取材：用75%乙醇消毒皮损边缘，用钝头刀从活动性皮损边缘向外刮取鳞屑（避免中央愈合区）。水疱型病变需挑破水疱取疱液，角化型病变需刮取深层角质。

特殊处理：若怀疑马拉色菌感染（如花斑癣），需采集胸背部淡褐色斑块的鳞屑，因该菌嗜脂性强，需避免与汗液混合。

甲样本

分层取材：真菌荧光染色液先清洁病甲，用钝刀刮去表层甲屑，再采集甲下碎屑（靠近甲床处）。若甲板增厚明显，可剪下病甲远端部分进行检测。

避免污染：取材时需防止健康甲组织混入，否则可能稀释真菌浓度导致假阴性。

毛发样本

根部优先：用镊子拔取无光泽或毛囊口折断的毛发，尽量保留毛根部。白癣（犬小孢子菌感染）可见发外成堆孢子，黑点癣（紫色毛癣菌感染）可见发内链状孢子，根部样本对鉴别诊断至关重要。

黏膜样本

口腔黏膜：用钝刀轻刮病变部位（如白色伪膜），或用拭子旋转擦拭。

阴道黏膜：真菌荧光染色液用无菌拭子深入阴道后穹窿取分泌物，避免触及宫颈口（减少黏液干扰）。

二、真菌荧光染色液样本处理：释放真菌结构

固态样本（皮屑、甲屑、毛发）

分散与压片：将样本置于载玻片上，用镊子轻轻分散皮屑或甲屑，避免堆积。毛发样本若多根聚集，需梳理开以减少染色遮挡。

压片技巧：盖上盖玻片后，用棉签或纸巾轻压，使样本形成薄层（厚度≤0.1mm），确保染色液充分渗透。

液态样本（痰液、尿液、分泌物）

离心浓缩：以1500-2000rpm离心5-10分钟，弃上清后取沉渣。痰液需先用痰液处理液液化（如4% NaOH），以溶解黏液并释放真菌。

干燥固定：沉渣可自然干燥或火焰固定（瞬间通过酒精灯火焰），避免高温破坏真菌结构。

三、真菌荧光染色液染色操作：荧光标记真菌

滴加染色液

用量控制：用移液器吸取50μL荧光染色液（含荧光素、KOH及复染剂），缓慢滴加至样本上，确保完全覆盖。

避免气泡：滴加时移液器尖端不接触载玻片，防止气泡干扰观察。

染色时间

常规样本：皮屑、分泌物等薄层样本染色1-2分钟即可。

厚硬组织：甲屑、角质层较厚的皮损需延长至5分钟，必要时可加盖湿盒保持湿润。

洗涤与压片

去除多余染液：用吸水纸从盖玻片边缘吸去多余液体，避免染色液残留导致背景荧光过强。

二次压片：再次轻压盖玻片，确保样本与染色液充分接触，同时减少气泡。

四、荧光显微镜观察：真菌荧光染色液精准识别真菌

设备准备

滤光片选择：使用紫外光激发滤光片（激发波长340-380nm，发射波长420-480nm），确保荧光信号清晰。

光源调整：调整光源强度至中等水平（避免过强导致荧光衰减或过弱影响观察）。

低倍镜筛查

快速定位：先用10×物镜浏览整个视野，寻找折光性增强的菌丝或孢子（荧光信号呈蓝绿色或黄绿色）。

背景对比：正常皮肤细胞无荧光，若观察到均匀淡绿色背景，可能是染色液残留，需通过调整焦距排除。

高倍镜确认

形态鉴别：切换至40×物镜，观察真菌特征：

皮肤癣菌：细长、分隔菌丝，沿表皮方向排列（如红色毛癣菌）。

念珠菌：芽生孢子+假菌丝（短菌丝分支），常见于黏膜感染。

马拉色菌：短粗、弧形菌丝与圆形孢子，呈“意大利面与肉球”样排列。

动态观察：轻微移动载玻片，观察荧光信号是否随真菌结构移动，排除杂质干扰。

五、真菌荧光染色液结果判读：结合临床综合分析

阳性结果

荧光形态：观察到蓝绿色荧光菌丝或孢子，且形态符合真菌特征（如分隔菌丝、芽生孢子）。

临床意义：结合病变部位（如足底脱屑+菌丝提示足癣）和病史（如宠物接触史提示犬小孢子菌感染）确诊。

阴性结果

排除干扰：若未观察到荧光，需确认：

样本采集是否到位（如甲屑是否取自甲下）。

染色时间是否足够（厚甲需延长染色）。

显微镜光源是否正常（荧光信号是否衰减）。

进一步检测：阴性结果不能完全排除感染，需结合培养（如沙氏葡萄糖琼脂培养基，25-28℃培养1-4周）或分子检测（如PCR）确认。

六、质量控制与注意事项

无菌操作：采样和染色过程中需避免污染，尤其是痰液、尿液等易受杂菌干扰的样本。

时效性：染色后需立即观察（荧光信号随时间衰减，1小时内最佳）。

假阳性处理：若观察到非特异性荧光（如结晶或杂质），需通过形态学（如菌丝分隔、孢子大小）和临床背景排除。

设备维护：真菌荧光染色液荧光显微镜需定期校准滤光片和光源，确保激发波长准确。